一、前言
在生命科學(xué)中，在許多情況下，及時(shí)且經(jīng)濟(jì)高效地檢測和定量樣品中的抗原或抗體非常重要。從識(shí)別接種疫苗或感染個(gè)體的免疫反應(yīng)，檢測您希望在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，到進(jìn)行質(zhì)量控制測試。擁有能夠進(jìn)行此類評(píng)估的工具是關(guān)鍵。
酶聯(lián)免疫吸附測定 （ELISA） 就是這樣一種測試，已被證明作為一種研究和診斷工具非常寶貴。在本文中，我們將考慮什么是 ELISA、它是如何工作的、技術(shù)的變化以及它可以告訴您什么。
二、什么是ELISA？
ELISA是一種免疫學(xué)檢測方法，通常用于測量生物樣品中的抗體或抗原，包括蛋白質(zhì)或糖蛋白。與其他免疫測定一樣，它們依賴于抗體與靶標(biāo)的結(jié)合來促進(jìn)檢測。
通常，ELISA檢測在96孔板中進(jìn)行，這種形式使其適合一次篩選多個(gè)樣品。血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解物、唾液、組織裂解物和尿液都是用于這些分析的常見樣品類型，但理論上可以使用大多數(shù)液體樣品類型。然而，重要的是要考慮到某些樣品類型可能包含抑制因子，例如具有相似抗原表位的緩沖液成分或蛋白酶等因子這可能會(huì)損壞靶標(biāo)或檢測組分，從而干擾檢測的性能。
有幾種不同的檢測形式，但都依賴于靶標(biāo)本身的結(jié)合或能夠?qū)袠?biāo)捕獲到板表面的抗體/抗原的結(jié)合。然后采用涉及偶聯(lián)抗原或更常見的抗體的檢測步驟來檢測和定量成功結(jié)合，最常見的是通過比色檢測。
三、ELISA的類型和檢測圖
ELISA 最初是由瑞典斯德哥爾摩大學(xué)的Eva Engvall和Peter Perlman以及荷蘭的Anton Schuurs和Bauke van Weemen于1971年互相獨(dú)立發(fā)明的。他們尋求一種能夠檢測抗原或抗體存在的免疫測定方法來取代放射免疫測定，后者使用具有潛在危險(xiǎn)的放射性標(biāo)記抗原或抗體，從而設(shè)計(jì)了一種基于酶的替代方案。
現(xiàn)在有四種主要類型的ELISA，直接、間接、夾心和競爭。
下圖說明了抗原的檢測；然而，相同的原理基本上適用于抗體檢測，抗原和一抗的作用是相反的。
ELISA 的類型
通過直接ELISA，樣品中的抗原或抗體以非特異性方式直接吸附到檢測板上。然后將對(duì)靶標(biāo)具有特異性的偶聯(lián)檢測抗體或抗原應(yīng)用于孔中。在此之后，使用檢測底物產(chǎn)生可測量的顏色變化，該變化可以在讀板器中量化。
由于該檢測步驟少，因此與其他ELISA方法相比，它更快且引入錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)更少。但是，由于吸附步驟是非特異性的，因此背景噪聲可能很高。沒有二抗步驟意味著沒有信號(hào)放大，從而降低了檢測靈敏度。它還需要為每個(gè)所需的靶標(biāo)創(chuàng)建偶聯(lián)檢測抗體/抗原。
直接ELISA
最初開發(fā)于1978年對(duì)于人血清白蛋白的檢測，間接ELISA或iELISA的工作原理與直接ELISA 非常相似，只是增加了二抗步驟。這使得測試信號(hào)的放大成為可能，克服了直接ELISA的限制。它還消除了對(duì)靶標(biāo)特異性偶聯(lián)檢測抗體/抗原的需求，因?yàn)榕悸?lián)的二抗只需要對(duì)一抗具有物種特異性。當(dāng)總樣品抗原結(jié)合到板上時(shí)，如直接ELISA，背景噪聲仍然是一個(gè)問題。但是，如果該檢測用于檢測樣品抗體，則純化的靶抗原被包被到板上，一抗來自樣品。這大大降低了背景噪音，因此這些分析法在測定樣品中的抗體滴度方面最受歡迎。
間接 ELISA 的缺點(diǎn)包括方案較長，出錯(cuò)的機(jī)會(huì)更多，并且可能與二抗發(fā)生交叉反應(yīng)。
開發(fā)于1977年，顧名思義，夾心ELISA將抗原夾在抗體之間。該技術(shù)可以采用直接或間接 ELISA形式（上面描述的夾心ELISA基于間接ELISA），不同之處在于捕獲抗體不是抗原與檢測板的非特異性結(jié)合，而是使其成為一個(gè)特異性過程。這種組合進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度和特異性。
然而，它們確實(shí)需要確定相容的捕獲和檢測抗體對(duì)才能有效發(fā)揮作用，而交叉反應(yīng)性可能會(huì)有問題。這種分析通常也具有最多的步驟，因此出錯(cuò)的機(jī)會(huì)更大。由于抗原結(jié)合步驟的選擇性，夾心ELISA在抗原處于復(fù)合物混合物中時(shí)特別有用，因?yàn)椴恍枰乖兓?br />
夾心ELISA
競爭性ELISA，也稱為抑制ELISA或封閉ELISA，可能是最復(fù)雜的ELISA技術(shù)。最初開發(fā)于 1976年對(duì)于人絨毛膜促性腺激素的檢測，該檢測通過檢測對(duì)預(yù)期輸出信號(hào)水平的干擾來工作，從而產(chǎn)生反比關(guān)系。所施加的樣品中的靶標(biāo)越多，檢測輸出信號(hào)就越低。有多種形式可供選擇，其他ELISA類型可以適應(yīng)競爭形式。但是，有兩個(gè)一般原則；樣品抗原或抗體與參比分別與有限量的標(biāo)記抗體或抗原結(jié)合。或者，樣品抗原或抗體可能與標(biāo)記的參考物質(zhì)競爭，分別與有限量的抗體或抗原結(jié)合。
競爭性ELISA將具有與其改編形式相同的一些優(yōu)勢和局限性。然而，當(dāng)抗原較小時(shí)，它會(huì)有所幫助，如限制兩種抗體同時(shí)結(jié)合的能力（如夾心ELISA的要求），或者當(dāng)只有一種抗體可用時(shí)。
競爭ELISA
四、ELISA步驟
雖然不同類型ELISA的實(shí)驗(yàn)方案存在差異，但應(yīng)考慮大多數(shù)檢測的共同階段。
大多數(shù)ELISA的第一步是將檢測的第一組分與檢測板結(jié)合。這通常是通過被動(dòng)吸附完成的，這是一個(gè)非特異性過程，因此結(jié)果將取決于應(yīng)用于板的物質(zhì)。如果應(yīng)用含抗原的樣品，則結(jié)果是板仍然需要選擇性步驟，因?yàn)楦鞣N抗原都會(huì)結(jié)合，而不僅僅是感興趣的抗原。但是，如果應(yīng)用純化的抗原（如用于抗體檢測的間接ELISA）或捕獲抗體（如夾心ELISA的情況 ），則可直接包被。
根據(jù)檢測的靶標(biāo)和性質(zhì)，可以使用多種板類型，其中大多數(shù)是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，具有不同的結(jié)合特性。一些靶標(biāo)，包括高度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA、脂質(zhì)、短肽和去污劑存在下的蛋白質(zhì)，不能很好地吸附。在這些情況下，建議使用經(jīng)過處理以允許與表面共結(jié)合的板。
向ELISA板中添加試劑后，必須對(duì)其進(jìn)行孵育，以便進(jìn)行結(jié)合或反應(yīng)。每次孵育的溫度和持續(xù)時(shí)間將取決于檢測步驟和所執(zhí)行的操作。通常在37 °C下孵育1~2小時(shí)或4℃過夜。
洗板是每一個(gè)步驟留下預(yù)期待測物或抗體的重要步驟。從孔中清空溶液后，用緩沖液（通常是磷酸鹽緩沖鹽水-吐溫20 （PBST））洗滌孔，以去除殘留的任何未結(jié)合抗原、抗體或試劑。這可以使用多通道移液器或使用自動(dòng)洗板機(jī)完成。洗滌不充分可能會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)高，而洗滌過多會(huì)導(dǎo)致樣品信號(hào)低。不一致的洗滌可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)板不一致，從而導(dǎo)致結(jié)果不可靠。
在用蛋白質(zhì)或抗體包被ELISA板后，通常需要封閉以防止以下方案步驟中檢測抗體的任何非特異性結(jié)合。將與測定無關(guān)的混合蛋白加入板中并在板中孵育，占據(jù)任何可用的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。常見的蛋白質(zhì)封閉緩沖液選擇包括脫脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白等?；蛘撸请x子去污劑，如Tween-20或Triton X-100，可用作封閉劑，但不能像蛋白質(zhì)那樣提供永久封閉。無效的板封閉會(huì)導(dǎo)致背景噪音增加并降低檢測的靈敏度和特異性。
抗體是大多數(shù)ELISA的基石，選擇合適的抗體至關(guān)重要，尤其是在使用多種抗體的情況下。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用，每種抗體都有自己的優(yōu)點(diǎn)和局限性。單克隆抗體具有高度特異性，但成本更高。另一方面，多克隆抗體可以在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合靶標(biāo)，從而放大信號(hào)并提高靈敏度。
使用采用二抗的方法會(huì)增加額外的步驟，延長檢測時(shí)間，增加出錯(cuò)的機(jī)會(huì)，并且需要更多優(yōu)化才能找到合適的兼容抗體對(duì)。然而，使用多克隆二抗的靈敏度增益可能使這成為開發(fā)有效檢測方法必不可少的。
無論使用哪種ELISA類型，所有ELISA都以檢測步驟結(jié)束，通常使用酶介導(dǎo)的可見顏色變化化學(xué)試劑，然后可以使用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測量。將酶偶聯(lián)抗原或抗體應(yīng)用于測試孔，如果存在靶標(biāo)，它將結(jié)合。當(dāng)酶的適當(dāng)?shù)孜锾砑拥桨逯袝r(shí)，它會(huì)導(dǎo)致與孔內(nèi)結(jié)合的靶標(biāo)量成正比的顏色變化。辣根過氧化物酶（HRP）是一種常見的偶聯(lián)物，與底物3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）合作使用，TMB在HRP的作用下變成藍(lán)色，然后在加入硫酸溶液后變成黃色，從而終止反應(yīng)。
然后可以使用酶標(biāo)儀（在添加終止液后檢測450 nm）確定每個(gè)孔的吸光度值，并根據(jù)分析設(shè)計(jì)進(jìn)行校正和計(jì)算，例如減去平均空白孔值、平均技術(shù)重復(fù)或與標(biāo)準(zhǔn)品的比率計(jì)算。
ELISA 工作流程示例
五、ELISA檢測結(jié)果分析
ELISA結(jié)果可以定量、定性或半定量。在定量分析中，使用已知標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常是光密度（OD）與濃度的關(guān)系曲線。由此，可以計(jì)算出未知樣品中靶標(biāo)的精確數(shù)量。
ELISA實(shí)驗(yàn)中未知物的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算和目標(biāo)濃度測定示例
在定性分析中，通常仍會(huì)使用酶標(biāo)儀以數(shù)值方式收集數(shù)據(jù)，但與沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白和/或陰性孔進(jìn)行比較，結(jié)果將被解釋為陽性或陰性。
半定量分析還可以在不使用連續(xù)稀釋或標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下收集數(shù)值數(shù)據(jù)。然而，同時(shí)包含陰性和陽性標(biāo)準(zhǔn)品（通常為高陽性和低陽性），有助于對(duì)未知樣品孔與已知狀態(tài)樣品孔之間的水平進(jìn)行相對(duì)比較。使用這些標(biāo)準(zhǔn)品監(jiān)測檢測重現(xiàn)性，可以設(shè)置一個(gè)臨界值，其中超過閾值的結(jié)果被確定為陽性，低于臨界值的結(jié)果被確定為陰性。
雖然在某些情況下可能需要定量分析，但在每個(gè)板上包含完整的標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)占用寶貴的孔。因此，根據(jù)使用者希望從檢測結(jié)果中獲得的信息，存在方式的權(quán)衡。
與許多檢測方法一樣，從ELISA獲得的結(jié)果很少可能達(dá)到100%準(zhǔn)確，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。因此，大多數(shù)測試將與敏感性和特異性的測量相關(guān)聯(lián)；它們?cè)浇咏?00%，測試就越好。
有許多因素會(huì)影響這些值，例如：非特異性結(jié)合或交叉反應(yīng)性從而帶來的高背景；抗體對(duì)靶標(biāo)的親和力差次；檢測條件；樣品條件和復(fù)雜性。
因此，計(jì)算靈敏度和特異性值是許多ELISA檢測開發(fā)中的重要步驟，尤其是在診斷環(huán)境中，以確定所獲得結(jié)果的信息量和可靠性。
